геномное секвенирование что это такое простыми словами

Секвенирование геномов для «чайников»

Геномика: постановка задачи и методы секвенирования

Сергей Николенко, кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник лаборатории вычислительной биологии Санкт-Петербургского Академического Университета в серии статей говорит о некоторых задачах биоинформатики, связанных со сборкой и анализом геномов, делая акцент на математической, комбинаторной постановке задачи. В данном, вводном, тексте речь идет о том, как выглядят входные данные для сборки геномов и как их получают.

Как выглядит молекула ДНК?

Начнем с того, как выглядит молекула ДНК. Молекулы полимеров характеризуются первичной структурой, под которой понимается просто состав молекулы (в данном случае – последовательность букв A, C, G и T, которые и составляют геном), вторичной структурой, т.е. тем, какие именно химические связи устанавливаются между этими компонентами и какие в результате получаются базовые пространственные структуры (в данном случае – двойная спираль), и третичной структурой, т.е. тем, как вторичная структура «уложена» в пространстве. Вторичная структура ДНК представляет собой двойную спираль, состоящую из четырёх разных нуклеотидов.

Рисунок из Википедии

Нуклеотиды обозначаются по содержащимся в них азотистым основаниям: аденину (A), цитозину (C), гуанину (G) и тимину (T) (есть ещё урацил, который в РНК заменяет тимин), и в дальнейшем мы всегда будем пользоваться этими буквами. В двойной спирали эти нуклеотиды связаны друг с другом водородными связями, и связь устанавливается по принципу комплементарности: если в одной нити ДНК стоит A, то в комплементарной нити будет T, а если в одной нити C, то в другой будет G. Именно это позволяет относительно просто проводить репликацию (копирование) ДНК, например, при делении клетки: для этого достаточно просто разорвать водородные связи, разделив двойную спираль на нити, после чего парная нить для каждого «потомка» автоматически соберётся правильно. Важно понять, что ДНК – это две копии одного и того же «текста» из четырёх «букв»; «буквы» в копиях не идентичны, но однозначно соответствуют друг другу. Например:

Было бы, конечно, удобно, если бы нам удалось аккуратно «вытянуть» одну нить ДНК и спокойно, нуклеотид за нуклеотидом, «прочесть» эту нить от начала до конца. При таком, идеальном, методе секвенирования (чтения ДНК) никаких хитрых алгоритмов не понадобилось бы. К сожалению, на данном этапе такое невозможно, и приходится довольствоваться результатами того секвенирования, которое есть.

Что такое секвенирование?

Секвенирование (sequencing) – это общее название методов, которые позволяют установить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК. В настоящее время нет ни одного метода секвенирования, который бы работал для молекулы ДНК целиком; все они устроены так: сначала готовится большое число небольших участков ДНК (клонируется молекула ДНК многократно и «разрезается» в случайных местах), а потом читается каждый участок по отдельности.

Клонирование происходит либо просто выращиванием клеток в чашке Петри, либо (в случаях, когда это было бы слишком медленно или по каким-то причинам не получилось бы) при помощи так называемой полимеразной цепной реакции. В кратком и неточном изложении работает она примерно так: сначала ДНК денатурируют, т.е. разрушают водородные связи, получая отдельные нити. Затем к ДНК присоединяют так называемые праймеры; это короткие участки ДНК, к которым может присоединиться ДНК-полимераза – соединение, которое, собственно, и занимается копированием (репликацией) нити ДНК.

Рисунок из Википедии

На следующем этапе полимераза копирует ДНК, после чего процесс можно повторять: после новой денатурации отдельных нитей будет уже вдвое больше, на третьем цикле – вчетверо, и так далее.

Все эти эффекты достигаются в основном с помощью изменений температуры смеси из ДНК, праймеров и полимеразы; для наших целей важно, что это достаточно точный процесс, и ошибки в нём редки, а на выходе получается большое число копий участков одной и той же ДНК. Разные методы секвенирования отличаются друг от друга не методами клонирования, а тем, как потом прочесть получившийся «суп» из многочисленных копий одной и той же ДНК.

Секвенирование по Сэнгеру

Первым методом секвенирования, который учёные сумели применить для обработки целых геномов (в том числе генома человека), стало секвенирование по Сэнгеру (Sanger sequencing). Смысл таков: участок ДНК клонируется, после чего полученная смесь делится на четыре части. Каждая часть помещается в активную среду, где присутствуют:

Собственно, процесс практически идентичен клонированию ДНК, с которым мы встретились в предыдущем разделе. Разница только в том, что теперь в один из нуклеотидов подмешаны «ложные» нуклеотиды; они могут образовать точно такую же водородную связь, но не могут продолжить свою нить дальше.

В результате в каждой части образуется большое число копий префиксов исследуемого участка ДНК, которые имеют разную длину, но всегда заканчиваются на одну и ту же букву – в зависимости от того, когда повезёт взять в процесс клонирования «ложный» нуклеотид. Например, в пробирке, где все последовательности заканчиваются на Т, из нашего примера выше получилась бы смесь из следующих префиксов:

ATGCAGAACAGACGATCAGCGACACTTTA (образец)
AT
ATGCAGAACAGACGAT
ATGCAGAACAGACGATCAGCGACACT
ATGCAGAACAGACGATCAGCGACACTT
ATGCAGAACAGACGATCAGCGACACTTT

Как теперь, получив такую смесь, «прочесть» геномную последовательность? Заметим, что в сумме в четырёх пробирках мы получили все возможные префиксы интересующего нас участка. Это значит, что если мы сможем просто измерить длину каждого префикса (точнее говоря, даже не измерить, а просто упорядочить, узнав, кто из них длиннее), то мы сможем узнать и последовательность тоже. Предположим, что мы увидели, что в пробирках лежат префиксы вот такой длины (по порядку, от самого лёгкого 1 до самого тяжёлого 10):A C G T
1, 5, 7, 8, 10 4, 9 3, 6 2

Очевидно, что эта последовательность начинается с А (т.к. самый лёгкий префикс, из одной буквы, заканчивается на A); дальше идёт C, дальше опять A, и так далее. В результате можно прочесть исходный участок: ATGCAGAACA.

А чтобы измерить длину, можно, например, измерить массу всех префиксов во всех пробирках. Чтобы измерить массу, можно, например (разные секвенаторы использовали разные процедуры, но суть от этого не меняется), ионизировать эти молекулы и отправить их наперегонки к заряженному электроду в специальном геле, который создаст трение и замедлит продвижение молекул – этот метод называется электрофорезом. При одинаковом заряде более тяжёлые молекулы будут двигаться медленнее, и в результате получится примерно такая картинка.

Рисунок из Википедии

Видно, что (в идеальном случае) можно просто прочесть последовательность нуклеотидов от самого лёгкого префикса (т.е. префикса из одной буквы) к самому тяжёлому.

Результаты и ошибки сэнгеровского секвенирования

На выходе из сэнгеровского секвенатора получаются короткие участки ДНК, так называемые риды (reads). Для биоинформатики принципиальны две вещи: во-первых, какой длины получаются риды, во-вторых, какие в них могут быть ошибки и как часто (разумеется, на свете нет ничего идеального).

Сэнгеровские риды по этим критериям очень хороши: получаются риды длиной около тысячи нуклеотидов, причём качество начинает заметно падать только после 700-800 нуклеотидов. Сам процесс секвенирования по Сэнгеру, с которым мы познакомились в предыдущем разделе, предопределяет и эффект падения качества (труднее отличить молекулу массой 700 от молекулы массой 701, чем массу 5 от массы 6), и другой неприятный эффект – если в геноме встречается длинная последовательность из одной и той же буквы (…AAAAAAAA…), трудно бывает точно определить, какой она длины – все промежуточные массы попадут в одну и ту же пробирку, некоторые из них могут не встретиться, некоторые слиться друг с другом и т.д. Но всё же сэнгеровское секвенирование даёт отличные результаты с достаточно длинными ридами, которые потом относительно легко собирать. О том, как это делается, мы будем говорить в последующих текстах.

Именно при помощи сэнгеровского секвенирования был впервые расшифрован геном человека. Секвенирование по Сэнгеру применяется и сегодня, но его всё активнее вытесняют другие методы, и применяется оно всё реже. Кому же и почему оно уступило свои позиции?

Секвенаторы второго поколения: Illumina

Современные секвенаторы – это так называемые секвенаторы второго поколения (SGS, second generation sequencing). В них участки ДНК по-прежнему многократно клонируются, но процесс чтения устроен не так, как у Сэнгера. Существует много разных методов, отличающихся довольно существенно, поэтому мы рассмотрим только один из них, один из самых популярных на сегодня – секвенирование по методу Solexa (ныне Illumina; в смене названия не нужно искать глубокий смысл, просто одна компания купила другую).

Процесс секвенирования Illumina проиллюстрирован на рисунке; кроме того, можно посмотреть один из нескольких существующих видеороликов с анимацией этого процесса – в данном случае, действительно, лучше один раз увидеть, чем сто раз прочесть текст. Однако краткие комментарии тоже пригодятся; вот как происходит процесс секвенирования по методу Illumina.

В результате на каждом цикле мы прочитываем одновременно очень большое число нуклеотидов из разных последовательностей. Но за это приходится платить тем, что участки ДНК, которые мы можем прочесть, оказываются гораздо короче, чем в случае секвенирования по Сэнгеру – риды Illumina обычно получаются длиной около 100 нуклеотидов.

Парные риды и постановка задачи

Есть ещё одна важная деталь. Участки ДНК «присасываются» к подложке обоими концами, причём мы можем узнать, какие последовательности соответствуют одному и тому же участку. Это значит, что в реальности мы читаем один и тот же участок, длина которого нам приблизительно известна, сразу с двух сторон. В результате данные получаются примерно такого вида:

причём расстояние между известными строчками (число вопросительных знаков) известно не совсем точно. В зависимости от технологии, можно получить как очень длинные неизвестные фрагменты (около 1000 нуклеотидов), «обрамлённые» двумя ридами длины 100, так и короткие фрагменты, в которых неизвестны буквально два-три десятка нуклеотидов между ридами. И те, и другие могут очень помочь в сборке, и об этом мы тоже будем говорить в следующих сериях.

Итак, теперь мы можем формально поставить задачу сборки геномов. Она звучит так: по большому числу подстрок небольшой длины восстановить исходную длинную строку в алфавите из букв A, C, G, T. В случае секвенирования по методу Illumina – по большому числу пар коротких подстрок, разделённых в исходной строке приблизительно известным расстоянием. Поставив эту задачу, мы можем забыть про биологию, химию и медицину – перед нами чисто алгоритмическая задача. Однако, прежде чем перейти к математике, сделаем ещё несколько замечаний.

Ошибки и показатели качества в секвенаторах второго поколения

Как мы уже знаем, секвенирование всегда содержит ошибки. В секвенаторах Illumina и аналогичных ошибки, как правило, происходят на фазе, когда нужно распознать помеченные нуклеотиды, т.е. понять, каким цветом и с какой силой светятся кластеры из многократно клонированных участков ДНК. На рисунке – типичный пример такой фотографии, порождённой секвенатором Illumina.

Рисунок с сайта medicine.yale.edu

Проблема здесь заключается в том, что из-за неидеальности остальных этапов процесса кластеры никогда не светятся только одним цветом; это всегда смесь всех четырёх цветов с той или иной интенсивностью. Нужно выделить наиболее интенсивную компоненту и оценить, насколько вероятна ошибка в этой букве; эта задача называется base calling (распознавание нуклеотидов). Base calling – это целая наука, в подробности которой мы сейчас вдаваться не будем.

Для нас сейчас важно, что в результате каждому нуклеотиду каждого рида секвенатор ставит в соответствие вероятность того, что этот нуклеотид был распознан правильно. Эти вероятности тоже можно использовать при сборке, и секвенаторы выдают их вместе с собственно ридами.

В итоге типичный рид в так называемом fastq-формате, стандартном для секвенаторов второго поколения, выглядит примерно так:

@EAS20_8_6_1_3_25/1
GCAAAAAACTTACCCCGGAACAGGCCGAGCAGATCAAAACGCTACTGCAATACAGACCATCAAGCACCAACTCCCNNNCGTAGNNNNNNTATGTTNNNNG
+EAS20_8_6_1_3_25/1
HHHHHHHGHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHEHHHHHHHHEGHHHHGHHGHEFD?A=A&FFBB>&::===@&@E@E>A#########################

Первая и третья строки содержат имя рида; вторая строка – сама последовательность нуклеотидов. Обратим внимание, что среди букв A, C, G, T встречаются и буквы N – это значит, что секвенатор не смог однозначно определить, какой здесь был нуклеотид, и сдался. А четвёртая строка кодирует, в логарифмическом масштабе, вероятности того, что тот или иной нуклеотид распознан правильно; например, H здесь соответствует вероятности ошибки около одной десятитысячной. Как правило, качество ухудшается к концу рида; в нашем примере, как видите, хвост рида и вовсе не удалось сколь-нибудь надёжно прочитать.

Другие методы секвенирования

Хотя мы подробнее всего рассмотрели секвенатор Illumina (Solexa), на самом деле на этом методе свет клином не сошёлся. Есть и другие секвенаторы второго поколения, с другими свойствами.

В секвенировании лигированием (sequencing by ligation) на фазе, когда уже нужно распознавать нуклеотиды, используют не ДНК-полимеразу и процесс репликации, а специальные короткие «зонды», которые присоединяются к комплементарным нуклеотидам, фиксируются, затем вымываются, и процесс повторяется снова. Так устроен секвенатор SOLiD от Applied Biosystems.

Пиросеквенирование (pyrosequencing) основано на хемилюминесцентных сигналах, которые подают специально модифицированные нуклеотиды, когда соединяются с комплементарным нуклеотидом в прочитываемой нити ДНК; на этом принципе работает, например, секвенатор 454 от 454 Life Sciences.

Принцип работы секвенатора PacBio (от Pacific Biosciences) очень похож на принцип работы Illumina, но у него по-другому устроен метод детектирования – специальные «решётки» позволяют уловить сигналы от отдельных молекул (метод получил название SMRT, single molecule real time sequencing). Это позволяет ускорить процесс, уместить больше ридов на одной подложке (нужно меньше клонировать ДНК, не нужно выращивать большие кластеры) и существенно увеличить длину надёжно прочитываемых ридов.

Недавно появившийся метод ионного полупроводникового секвенирования (на нём основан секвенатор IonTorrent) вместо всего этого просто детектирует соединения (ионы), которые выделяются при присоединении нового нуклеотида к нити ДНК. Это позволяет радикально сократить время и стоимость получаемых ридов, хотя процент ошибок становится больше, и больше становится ошибок в фрагментах из повторяющейся одной буквы.

Человеческая мысль не стоит на месте: методы секвенирования постоянно улучшаются. Однако практически все современные методы выдают относительно короткие риды, от 100 до 400 нуклеотидов; в этом цикле мы будем в основном говорить о том, как собирать именно короткие риды.

Sanger или Illumina?

Человеческий геном был впервые собран на сэнгеровских секвенаторах, причём алгоритмическая сторона того проекта была проработана гораздо меньше, чем сейчас, десять лет спустя. Алгоритмы, которыми собирали первый человеческий геном, значительно проще тех, о которых мы будем говорить в дальнейшем. Однако первый геном всё-таки собрали; может быть, весь алгоритмический прогресс – это никому не нужный миф, и вполне хватило бы старых программ?

Невероятно, но факт: «старые» секвенаторы (первого поколения, сэнгеровские) выдают значительно более подходящие для сборки данные, чем «новые» (второго поколения). Это в основном выражается в длине ридов (reads), тех участков ДНК, которые удаётся последовательно прочесть, и которые, собственно, и нужно собрать в одну большую строчку. Секвенаторы первого поколения выдавали риды длиной более пятисот нуклеотидов, обычно около тысячи. Современные секвенаторы выдают пары ридов, каждый из которых имеет длину около ста нуклеотидов.

На таком уровне становится важной и цена алгоритмической стороны вопроса. Чтобы сборка геномов не занимала дольше и не стоила дороже, чем само их секвенирование, нужно разработать очень быстрые алгоритмы для решения задачи сборки. Об этом пойдет речь в следующей статье.

Источник

Код жизни: прочесть не значит понять

Код жизни: прочесть не значит понять

Секвенирование геномов — это не только самые современные приборы, но и большой объем вычислений на суперкомпьютерах!

Авторы

Редакторы

Последний год жизни авторы этой статьи посвятили созданию инфраструктуры по получению, хранению и анализу кода жизни — генетической информации, которая записана в молекуле ДНК. Что такое ДНК с точки зрения математика, каковы основные принципы построения компьютерной архитектуры для анализа огромных массивов генетической информации и что ждать в будущем от тотальной прозрачности и доступности теперь уже и нашего индивидуального кода жизни, — обо всём этом расскажет предлагаемая вашему вниманию статья.

Сегодня все знают, что информация, необходимая оплодотворённой яйцеклетке, чтобы развиться сначала в эмбрион, а потом и во взрослый организм, записана в молекулах ДНК, последовательность нуклеотидных остатков в которой можно представить в виде текста. В этом тексте, как и в любом другом, самое важное — это последовательность букв (в ДНК их, как известно, всего четыре). Совокупность всех молекул ДНК ядра клетки (каждая из которых, взаимодействуя с белками, образует отдельные хромосомы) называют ядерным генóмом (митохондрии, бывшие в незапамятные времена свободноживущими микроорганизамами, имеют свой собственный геном). К примеру, бактерии, обитающие у нас в кишечнике и помогающие переваривать пищу, имеют геном длиной порядка нескольких миллионов букв. Простая вошь — уже 500 миллионов, а геном человека составляет более трех миллиардов букв. Для сравнения, все четыре тома «Войны и мира» Толстого содержат около двух миллионов букв, — т. е., примерно эквивалентны генетической информации бактерии, а геном человека можно сравнить со всей библиотекой Толстого в Ясной Поляне. (С другой стороны, объём кинофильма в формате Blu-ray уже существенно превосходит размер генома, — так что говорить нужно, конечно, не только об объёме информации, но и о её «качестве».)

В первом приближении можно считать, что все клетки взрослого человека имеют один и тот же генетический текст. («Нормальное» исключение составляют половые клетки и лимфоциты, а патологическое — клетки раковой опухоли.) Так же, как и в книге, где фрагменты текста объединяются в главы, в геноме протяжённые последовательности нуклеотидов объединяются в гены, контролирующие функции клетки и организма [1]. Лишь десять лет назад геном человека был в общих чертах «прочитан» — в 2000 году две команды исследователей объявили о независимом друг от друга завершении проекта по секвенированию (определению последовательности ДНК) генома человека. Результат их работы сейчас считается «золотым стандартом» генома человека (то, с чем исследователи, как с эталоном, сравнивают вновь полученные генетические тексты). Общие затраты на эту работу оцениваются в интервале 3–10 миллиардов долларов [2].

Словарик

Читать — не перечитать

За прошедшие 10 лет технологии расшифровки генетических последовательностей развивались очень бурно, — в первую очередь, благодаря миниатюризации и автоматизации [3]. Следующее поколение методов секвенирования «информационных» молекул, будет, несомненно, связано с переходом к определению последовательности единичных молекул ДНК/РНК с применением нанотехнологических подходов. (Подробнее об этих технологиях, уже делающих первые уверенные шаги, «биомолекула» как-нибудь обязательно расскажет.)

Современная геномная лаборатория — например, Лаборатория геномики в Курчатовском Институте в Москве, — способна за один день «начитать» последовательность длиной до 20 миллиардов нуклеотидов. Что же касается стоимости таких работ, — прочтение одного человеческого генома уже подешевело почти до 10 000 долларов, — т. е., за 10 лет цена упала на 6 порядков (в миллион раз!). По оценкам экспертов, ценовой рубеж, когда персональная геномика войдёт в жизнь каждого из нас через медицину, страховки, работодателей и через прочие социальные институты, составляет 1000 долларов за индивидуальный геном. По всей видимости, он будет достигнут в ближайшие 5 лет.

Видимо, следует сделать оговорку — каждым из 6 миллиардов, достаточно обеспеченным, чтобы позволить себе тратить деньги на такие «пустяки». — Ред.

Внешние отличия, умственные способности и даже психологические особенности каждого человека в той или иной степени заложены в его геноме [4]. (Конечно, не стоит считать эти качества 100%-предопределёнными.) Считается, что основные генетические отличия одного человека от другого сосредоточены в однобуквенных заменах — своеобразных «опечатках» или «вариантах» текста ДНК, называемых однонуклеотидными полиморфизмами (ОНП). Как одна буква в названии книги «Война и мир» способна изменить его смысл (к примеру «Война и мор»), так и замены в генетических текстах могут привести к тому, что, например, одни люди будут болеть чаще, чем другие. Одни из нас — высокие и черноглазые, а другие — низкие и с голубыми глазами, и этим мы тоже обязаны генам. (И не только мы — например, «белая» окраска лошадей тоже обусловлена генетически [5].)

Зная генотип человека, теоретически можно предсказать многие его характерные черты, — не только цвет глаз и рост, но и предрасположенность к заболеваниям (именно это больше всего и интересует учёных и врачей) и даже к вредным привычкам [6]! Однако самое сложное здесь то, что большинство таких признаков определяется совокупностью большого, хотя и конечного числа «опечаток» в геноме, которые потребуется обнаружить. Результат появления той или иной «опечатки» не всегда бывает предсказуемым и понятным. Зачастую эффект от замены одной буквы слишком незначителен, и у исследователей нет ясности, как она в принципе может влиять на фенотип. Однако совокупность сотен и тысяч ОНП может эмпирически коррелировать с тем или иным признаком, хотя механизм, обусловливающий связь с признаком, может оставаться загадкой. Для этого необходимы данные о генотипах различных групп людей — как здоровых, так и больных, — чтобы иметь достаточную статистику для анализа отличий в геномах и поиска тех «опечаток», которые ответственны за склонность к заболеванию. (Подробнее о таких исследованиях, получивших название GWAS — genome-wide association studies — см. в статье «Загадочная генетика „загадочной болезни кожи“ — витилиго» [7].) Например, для проекта по исследованию рака почки генотипировано больше 12 тысяч человек. Таких проектов в мире можно насчитать уже несколько десятков, — то есть, всего насчитывается уже несколько сотен тысяч людей с установленными генотипами. Кстати говоря, уже и число полных геномов перевалило за тысячу [8].

Технология

Современные технологические платформы, предназначенные для чтения генетических текстов (для простоты такие приборы называют секвенаторами «нового поколения»), определяют последовательность не всей молекулы ДНК за раз, а лишь достаточно скромных её фрагментов — при большей длине, увы, возникает слишком много ошибок. Стадии секвенирования предшествует случайное «измельчение» ДНК на отрезки со средней длиной 500 нуклеотидов; само «считывание» осуществляется сразу с двух физических концов этого отрезка, в результате чего образуется пара фрагментов «текста» ДНК. Длина таких фрагментов, являющихся основным результатом работы секвенатора и на жаргоне именуемых «ридами» (от англ. read — читать), колеблется (в зависимости от производителя оборудования) в диапазоне 35–400 букв. Следует отметить, что большáя часть последовательности фрагмента неизбежно остаётся непрочитанной, поскольку длины «рида» (допустим, 100 букв) не хватает, чтобы перекрыть всю длину фрагмента (≈500 букв).

Подробнее об инструментальных основах секвенирования мы уже писали (см. «454-секвенирование (высокопроизводительное пиросеквенирование ДНК)» [3]); сейчас же разговор пойдёт главным образом о том, как скомбинировать из огромной библиотеки фрагментов текста «готовую» генетическую последовательность, как она записана в геноме. Современный прибор за один запуск длительностью около 10 дней способен сгенерировать до 300 миллионов пар «ридов» (рис. 1). Точная сборка этого «стройматериала» в геномную последовательность — проблема не из лёгких, и решаться она может двумя путями, в зависимости от наличия «эталонного» генома.

Рисунок 1. Секвенаторы SOLiD компании Applied Biosystems (Life Technologies) в лаборатории Queensland Centre for Medical Genomics, Австралия. Одна из миссий центра — «разрабатывать и улучшать технологию для рутинного анализа полной последовательности человеческого генома». Научных институтов, ориентированных на развитие «персонализованной медицины», с каждым годом становиться все больше и больше.

Задача первая: ресеквенирование

Возвращаясь к аналогии с произведением Льва Николаевича, ресеквенирование можно сравнить с поиском опечаток в исходном тексте «Войны и мира». Мы считаем, что геном изучаемого объекта имеет то же строение, что и «золотой стандарт» генома 2000-го года (хотя и этот эталон постоянно уточняется — сейчас доступна уже 37-я его версия). Сопоставляя участки текста, для каждого из многих миллионов «ридов» определяются его координаты на одной из хромосом: «страница», «абзац», «отступ слева» и т. д. В случае если обнаруживается расхождение с эталоном — опечатка, маленькая вставка или выпадение текста (на жаргоне такие отличия называют short indels — short insertions/deletions), — эти вариации включаются в отчёт о сравнении. Так, сравнивая миллионы и миллиарды «ридов» с исходным текстом, можно получить полный перечень отличий изучаемого генома от эталонного «золотого стандарта». Более того, если каждая буква исходного текста проверяется многократными прочтениями, это увеличивает статистическую достоверность найденных генетических особенностей и аномалий. Сегодня считается, что геном ресеквенирован с высоким «покрытием» (deep sequencing), если каждая его буква была прочитана в среднем 30 раз или более (30×).

С точки зрения биоинформатических алгоритмов, ресеквенирование — это относительно лёгкая процедура: для обработки данных от одного запуска прибора требуется всего около 10 часов работы программы на 20 процессорных ядрах и 20 Гб оперативной памяти.

Рисунок 2. Общий принцип секвенирования нового («второго») поколения. Первый этап процесса подготовки образца состоит из фрагментации длинных молекул ДНК ультразвуком или каким-нибудь другим методом, не зависящим от последовательности ДНК, до размера 250–500 пар нуклеотидов. Далее следует стадия, во время которой концы ДНК-фрагментов приводятся в порядок: сначала удаляются или достраиваются выступающие концы молекул, затем лигируются адаптерные олигонуклеотиды. Полученная библиотека предварительно амплифицируется для увеличения представленности каждого фрагмента ДНК. Последний шаг — создание молекулярных колоний — клональная амплификация каждого фрагмента библиотеки на твердой поверхности. Все это происходит вне секвенатора. Расшифровка последовательности ДНК-фрагментов происходит через параллельный анализ миллионов и даже миллиардов молекулярных ансамблей в секвенаторе. В приборе стадии подачи реактивов для секвенирования (нуклеотидов или олигонуклеотидов с флуорофором и соответствующих ферментов) чередуются со стадиями сканирования поверхности и регистрации получаемых изображений.

Задача вторая: секвенирование de novo

Вторая задача является и экспериментально, и алгоритмически, и вычислительно более сложной — тут требуется реконструировать текст из набора «ридов», не имея эталона для сборки. Подход основан на том, что, в силу случайности разбиения молекул ДНК на фрагменты, при достаточно плотном «покрытии» обязательно найдутся несколько частично перекрывающихся «ридов», при совмещении которых текст будет постепенно наращиваться. «Подрастающий» текст (в данном случае называемый контигом) используется для поиска среди миллиарда «ридов» такого, который максимально (но не полностью) с ним перекрывается.

Процедура объединения контигов продолжается до тех пор, пока с обоих концов фрагмента генетического текста не начнутся области протяжённых повторов, характерные для «кончиков» хромосом. Если повтор имеет длину большую, чем длина «рида», то его длина, а значит, и точная последовательность, остаётся неизвестной. Однако здесь на помощь приходит информация о парности чтений: как правило, они находятся на более-менее известном расстоянии друг от друга. Таким образом, если одно из чтений пары попадает на один контиг, а второе — на другой, то эти контиги можно объединить в связку, называемую скаффолдом. Впоследствии непрочитанные «дыры» в скаффолдах можно будет прочесть другими методами. Сборка de novo является алгоритмически сложным и вычислительно затратным процессом.

Рисунок 3. Повторное секвенирование («ре-секвенирование») генома с целью выявления разнообразных структурных вариаций (однонуклеотидных полиморфизмов, или «снипов», а также инсерций, делеций, повторов, инверсий, транслокаций). В отличие от секвенирования неизвестных последовательностей de novo, при котором прочтения соотносятся друг с другом и собираются в контиги, для ре-секвенирования достаточно просто «картировать» прочтения на референсную последовательность, уже имеющуюся под рукой. Снипы выглядят как однонуклеотидные замены в коротких прочтениях, при этом количество прочтений с заменой говорит о состоянии аллеля — гомозиготном (все прочтения с заменой) или гетерозиготном (половина прочтений с заменой).

Такие задачи решаются с использованием теории графов, но идеального «сборщика» текстов для de novo-секвенирования ещё не создали. Основной проблемой сборки является наличие в генетических текстах длинных (от 200 до нескольких тысяч букв) элементов, содержащих повторы длиной от 4 до 150 нуклеотидных оснований. Очевидно, что именно из-за присутствия повторов текст во время сборки может оборваться. Для преодоления этого используют экспериментальные ухищрения, заключающиеся в генерации исходной библиотеки фрагментов со средней длиной не 500, а 3000 или даже 10000 букв. В этом случае существенно увеличивается вероятность захватить парой «ридов» уникальные участки текста, оставив повторы внутри.

Описав очень схематично схему алгоритма секвенирования, приступим к описанию вычислительных мощностей, которые авторы привлекают для анализа генетических текстов.

Секвенирование: без суперкомпьютеров не обошлось

«Сборка» текста генома из набора фрагментов, полученных на секвенаторе, — алгоритмически и вычислительно сложная задача, невозможная без использования суперкомпьютерных кластеров. Например, каждая сборка генома печёночного сосальщика, основанная на данных нескольких запусков секвенатора, требует до недели работы кластера из двух десятков узлов по 8 ядер и 8 Гб оперативной памяти в каждом (объединение по интерфейсу MPI). Однако одного запуска почти всегда недостаточно — таких сборок может быть несколько из-за необходимости подбора оптимальных параметров алгоритма и добавления новых экспериментальных данных. Есть и альтернативные варианты решения этой задачи, основанные не только на кластерах, но и популярных сегодня «облачных» вычислениях.

В целом, сборка de novo является более перспективным методом, чем ресеквенирование, и практически единственным подходом — когда эталонной последовательности генома исследуемого организма ещё не существует (как правило, для этого и проводится первое секвенирование). Оно позволяет выявлять существенные перестройки в геноме, обозревая его как одно целое. Впрочем, для многих практических целей и ресеквенирования бывает вполне достаточно.

Запрограммируй это

Читателю уже должно было стать ясно, что без серьёзных компьютерных мощностей решить задачу секвенирования генома шансов немного. Некоторые исследователи видят решение проблемы доступности дешёвых вычислений в так называемых «персональных суперкомпьютерах», под которыми имеются в виду системы на базе графических процессоров. Действительно, их специализация на операциях с векторами и массивная параллелизация находят всё более широкое применение во многих областях науки. В то же время относительно низкая цена и стоимость и владения такими компьютерами существенно снижают порог вхождения; их могут позволить себе не только институты, но и отдельные лаборатории.

Однако переход на новую технологию обязательно приносит с собой ряд проблем, и в биоинформатике они ощущаются особенно остро. В частности, часто необходимо использовать специальные алгоритмы, требующие от программиста знания архитектуры графических процессоров; в то же время большинство программного обеспечения в биологии разрабатывается биологами, для которых программирование — лишь дополнительный навык. Это же обусловливает и приверженность биологов к скриптовым языкам программирования: часто требуется написать простую программу «на раз» — только для проверки очередной гипотезы. Традиционно используемый в биоинформатике язык Perl на настоящий момент не имеет доступа к OpenCL (программный комплекс для облегчения программирования графических процессоров), хотя некоторые другие языки, например, Python или Java, уже оснащены привязкой к этому фреймворку.

Можно назвать три основных особенности использования графических сопроцессоров в геномной биоинформатике. Во-первых, это текстовый формат геномных данных, в то время как единого стандарта для их представления в удобном (с точки зрения вычислений, компактном и быстром) цифровом виде до сих пор нет. Во-вторых, высокая «квантуемость» данных («ридов» секвенатора, полиморфизмов и др.) способствует многопоточной обработке. И, в-третьих, огромные требования к оперативной памяти, запас которой непосредственно на графическом ускорителе пока относительно мал; это может привести к дополнительному усложнению и без того порой неочевидных алгоритмов.

Требования к аппаратному обеспечению, накладываемые практическими задачами, почти всегда опережают реальные возможности вычислительных машин. Для многих приложений биоинформатики — таких как сборка геномов de novo — часто не хватает ресурсов даже самых современных кластеров, включающих сотни вычислительных узлов, соединенных быстрой сетью Infiniband.

Возможное решение проблемы компьютерных мощностей — глобальная грид-инфраструктура, объединяющая десятки суперкомпьютерных центров и позволяющая использовать их мощности через единый интерфейс. Кроме того, грид-технология позволяет создавать распределённое хранилище данных, — а ведь когда речь идёт о геномике, дискового пространства не бывает много. Последнее время это направление распределённых вычислений очень активно развивается, — например европейский проект EGEE является примером создания крупнейшей грид-инфраструктуры, объединяющей участников из более чем 50 стран и включающей в себя более 260 компьютерных центров. Общее количество вычислительных ядер в этой сети более 150 тысяч, а дисковое пространство превышает 28 петабайт. Возможно, использование грид-технологий сможет отодвинуть границу доступных задач в биоинформатике уже в самом ближайшем будущем.

Секвенирование геномов в России

Надо сказать, что в нашей стране дела с полногеномным секвенированием не так уж и плохи. Первые секвенаторы «нового поколения» — приборы Applied Biosystems (сейчас в составе Life Technologies) SOLiD и Illumina GAII — заработали в Российском научном центре «Курчатовский институт» в начале 2009 года. В Лаборатории геномного анализа, которую возглавляет Егор Прохорчук (специально для этого вернувшийся из-за границы), и был расшифрован первый российский геном человека. Разумеется, русского человека. Предварительные результаты этой работы были опубликованы в отечественном журнале Acta Naturae [10]. В настоящее время в лаборатории ведется работа по расшифровке ещё нескольких человеческих геномов в рамках крупного международного проекта по исследованию раковых заболеваний.

Сейчас Курчатовский институт (со своим отдельным финансированием и руководством, не зависящим от Российской академии наук) является самым крупным российским геномным центром, заметным даже по европейским меркам (но не по американским или китайским, где число секвенаторов только одного типа может переваливать за сотню). Но и другие институты, уже в составе РАН, не отстают от «Курчатника» (см. таблицу). Как известно, Россия прирастает Сибирью. Сибиряки из Института химической биологии и фундаментальной медицины, что находится в новосибирском Академгородке, имеют в своём распоряжении две, в некотором смысле комплементарные, платформы для высокопроизводительного секвенирования — SOLiD и 454 FLX Titanium («Roche — всем хорош»). В институте работает центр коллективного пользования «Секвенирование ДНК», которым руководит доктор Игорь Морозов. Именно в этом ЦКП и осуществляется несколько различных научных проектов с использованием высокопроизводительных секвенаторов.

Медицинские НИИ тоже участвуют в полногеномных исследованиях. В НИИ физико-химической медицины в лаборатории профессора Вадима Говоруна прибор Applied Biosystems SOLiD 4 будет работать на благо российской биомедицины.

Также пара мощных приборов двух конкурирующих компаний (Life Technologies и Illumina) устанавливаются в Москве в Институте общей генетики РАН им. Н. И. Вавилова в лаборатории профессора Евгения Рогаева, известного и за рубежом российского ученого, прославившегося своими исследованиями болезни Альцгеймера, а также расшифровкой ДНК из останков царской семьи [11].

Ещё несколько приборов разбросанно по московским и периферийным институтам; один SOLiD скоро заработает в коммерческой компании, специализирующейся на предоставлении услуг по высокопроизводительному секвенированию и генотипированию. Такая картина не может не вселять определенный оптимизм в стороннего наблюдателя, следящего за вялым возрождением отечественной науки. Остается только с нетерпением ждать появления публикаций в престижных журналах, ведь у работ с привлечением (пока еще!) передовых методов и оборудования шансов на успех должно быть больше.

Заключение

Как же будет выглядеть персональная геномика через несколько лет? Нам видится, что буквально в каждом крупном городе будет лаборатория по чтению индивидуальных геномов. Скорее всего, не стоит опасаться того, что индивидуальная информация станет доступна лаборанту, обслуживающему секвенатор — он все равно не сможет её интерпретировать. Хотя, безусловно, сохранности персональной тайны пациента следует уделить самое пристальное внимание. Последовательности геномов будут поступать в единый информационный центр, который проведёт автоматизированный анализ и сравнение с геномами других людей, для которых уже создана история болезни. На основании этого можно будет делать индивидуальный прогноз для каждого пациента, который, быть может, ещё и не пациент вовсе, а всего лишь новорожденный.

Более того, все болезни, физические параметры, психофизиологические особенности, наблюдаемые у него в будущем, также можно будет занести в его персональный файл и соотнести с генетическим текстом. Приходя на приём к врачу, человек получит рекомендации по лечению и приёму лекарств, наиболее соответствующих его метаболизму и предрасположенностям.

. Над всем этим неумолимо нависает призрак киберпанка, предвосхищая растворение человека в океане цифр и знаков. Большой брат будет следить и за тобой. Но только если ты этого захочешь. Это наступит неотвратимо, но не через один год жизни...

Первоначально сокращённый вариант этой статьи был опубликован в журнале «Суперкомпьютеры» [9].

Статья написана в соавторстве с Чекановым Н.Н. и Теслюком А.Б. при участии коллектива «биомолекулы». Врезку, таблицу, картинки и «словарик» подготовил Павел Натальин.

Источник